In vivo CAR-T 技术革命：全式金全链条赋能方案
In vivo CAR-T 疗法：下一代细胞治疗技术革命
CAR-T 细胞疗法是通过基因改造患者T细胞，使其表达特异识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体（CAR），从而实现精准杀伤肿瘤。传统 CAR-T 疗法（ex vivo）已在血液肿瘤中得到充分验证，但其复杂的制造流程—白细胞分离、体外激活、病毒转导、扩增培养、冻存运输和回输前淋巴清除—导致 2~7 周的“静脉到静脉”周期，产品高度个性化、批次间差异大、单例治疗费用高达数十万至百万美元，严重限制了患者的可及性。
In vivo CAR-T 疗法正是在这一背景下应运而生的颠覆性技术路线。与体外制备不同，In vivo CAR-T 通过单一“即用型”制剂直接给药，在患者体内完成 CAR 基因的导入与表达，生成功能性的 CAR-T 细胞。该技术路线在 2025—2026 年间取得了突破性进展：Kelonia Therapeutics 的 KLN-1010 在多发性骨髓瘤I期试验中，无需淋巴细胞清除化疗即实现 MRD 阴性缓解。日本 ESO-T01 抗 BCMA CAR-T 疗法的I期数据同样显示，无需白细胞分离和清淋化疗即可在体内生成 CAR-T 细胞。学术研究也证实，In vivo CAR-T 细胞可在体内扩增至免疫细胞总量的40%，成功清除骨髓和脾脏中的肿瘤细胞。
In vivo CAR-T 的核心优势可概括为：流程大幅简化、治疗周期显著缩短、成本降低 90% 以上、适用患者群体拓宽、可在完整免疫网络环境下实现T细胞表位扩展。
In vivo CAR-T 工艺流程及全式金产品支撑
In vivo CAR-T 疗法的开发与生产可划分为上游研发—递送载体制备—质量控制与验证三大阶段。目前技术路线主要包括：
路线 | 核心载体 | 优势 |
定向病毒载体 | 工程化慢病毒/逆转录病毒（含靶向配体） | 基因整合持久表达，CAR 活性强 |
LNP 递送 | 脂质纳米颗粒递送 mRNA | 安全性高，工艺简便，无整合风险 |
外泌体递送 | 工程化外泌体装载 CAR mRNA | 免疫原性低，储存运输便捷 |
全式金生物凭借覆盖分子生物学、细胞生物学、蛋白质研究的完整产品线，可为 In vivo CAR-T 全流程提供解决方案。
一、上游研发阶段—CAR 基因设计与质粒构建
In vivo CAR-T 的上游起点是 CAR 基因的结构设计与质粒载体构建。无论后续选择病毒载体、LNP 还是外泌体路线，这一阶段都是所有技术路线共用的核心环节。CAR 基因的结构设计决定了 CAR-T 细胞的功能特性，而质粒载体构建则是将 CAR 基因导入递送系统的关键步骤。全式金生物在基因克隆与质粒构建领域拥有丰富的产品矩阵。
核心产品推荐:
分类 | 产品 | 特点 |
高保真扩增 | • 扩增速度快，≤5 kb 基因可实现 12 kb/min 高速扩增，＞5 kb 基因可达到 6 kb/min 快速扩增。 • 保真性是 EasyTaq® 的108 倍。 • 基因组 DNA 片段的扩增（≤15 kb）。 • Plasmid DNA 片段扩增（≤20 kb）。 | |
无缝克隆 | • 支持最多 15 个片段一步连接。 • 5-15 min快速重组。 • 可构建 31.8 kb 质粒。 • 兼容低至 0.003 pmol 片段。 • 提供在线引物设计工具。 | |
无内毒素质粒大提 | • 一管式：单支 50 ml 离心管内即可完成单次 100 - 500 ml 菌体的裂解中和，无需准备大容积耗材。 • 可视化：溶液 LB III ( 蓝色)，通过颜色的变化，指示裂解、中和是否完全。 • 速度快：小体积配合大离心柱，大幅降低离心次数，节省操作时间。 • 无内毒素：纯化所得质粒内毒素可低于 0.1 EU/μg，最低可至 0.001 EU/μg。 • 产量高：纯化柱核酸载量高达 5 mg。 |
在上游质粒构建完成后，In vivo CAR-T 有多条技术路线的选择空间。全式金的产品线可同时覆盖病毒路线、LNP 路线和外泌体路线，为客户提供技术路线的全面选择。
三条主流技术路线的质粒设计差异：
• 慢病毒载体路线：通过多质粒共转染包装细胞，产生可靶向 T 细胞的重组慢病毒颗粒。具体采用三质粒或四质粒系统，包括 CAR 表达质粒、包装质粒（Gag/Pol/Rev）和包膜质粒（含抗 CD3 scFv 等 T 细胞靶向配体）。
• LNP 递送路线（非病毒）：以体外转录（IVT）合成的 mRNA 为核心功能分子，通过脂质纳米颗粒封装后体内递送。其 IVT 质粒除 CAR 序列外，还包含 T7 启动子、优化 5’UTR/3’UTR 及 Poly(A) 尾；自扩增 RNA（saRNA）路线需额外插入病毒复制酶序列。
• 外泌体递送路线（非病毒）：利用工程化外泌体天然装载 CAR-mRNA 并展示靶向分子，安全性高且易于储存运输。该路线涉及靶向质粒（融合支架蛋白展示T细胞配体）、CAR 质粒（含外泌体分选信号）及支架蛋白表达质粒，共转染生产细胞后获得功能化外泌体。
mRNA 体外合成（LNP 与外泌体路线原料制备）
非病毒路线的核心功能分子是 mRNA。LNP 和外泌体递送通常均依赖体外转录（IVT）技术合成 CAR-mRNA，其纯度、加帽效率及加尾均一性，直接影响体内翻译效率与 CAR 表达水平。全式金提供从转录、加帽到加尾的完整 mRNA 合成产品线。
核心产品推荐：
分类 | 产品 | 特点 |
T7 体外转录 | • 每 20 μl 反应体系可生成 120~180 μg RNA。 • UTP 替换为 N1-Methyl-Pseudo-UTP ，免疫反应更低。RNA 稳定性更好，表达效率更高。 | |
• 转录与加帽一步完成，操作便捷。 • 帽类似物加帽，加帽效率更高。 • 每 20 μl 反应体系可生成 120~160 μg RNA。 • UTP 替换为 N1-Methyl-Pseudo-UTP ，免疫反应更低。RNA 稳定性更好，表达效率更高。 | ||
mRNA 修饰 | • 简便快捷，1 小时内得到 Cap1 加帽产物，加帽效率高。 • 可对不同长度的 mRNA 进行加帽，可根据实验需要放大或缩小反应体系。 • 提供全套加帽反应原料只需自备 RNA 即可进行加帽反应。 | |
• 加尾效率高且加 A 长度较为一致。 • 可根据实验需要放大或缩小反应体系。 • 加帽后的 mRNA 可直接用于 TransGen 产品（LA201）进行加尾反应。 • 提供全套加尾反应原料，只需自备 RNA 即可进行加尾反应。 |
二、递送载体制备与生产
将核酸分子转化为体内递送制剂，决定载体的靶向性、转导/转染效率及工艺可放大性。该阶段是 In vivo CAR-T 从基因蓝图走向功能性产品的关键转化环节。不同技术路线需采用差异化的生产策略：慢病毒路线侧重包装细胞转染与病毒颗粒的纯化浓缩，而 LNP 和外泌体路线则关注纳米颗粒的组装与装载效率。高质量的载体制备直接决定了体内 CAR-T 细胞的生成效率与治疗安全性。
慢病毒载体路线：
慢病毒是目前 In vivo CAR-T 中应用最成熟的载体，可实现T细胞特异性转导和 CAR 基因的长期整合。稳定的病毒包装与高效浓缩是保证体内药效和剂量一致性的基础。
核心产品推荐：
分类 | 产品 | 特点 |
转染试剂 | • 应用范围广：本产品适合于 HEK-293、CHO 等多种贴壁或悬浮细胞的瞬时转染和稳定转染。 • 转染效率高：适合于质粒 DNA 的高效转染，HEK-293、HEK-293-F 的转染效率大于 90%，CHO-S、CHO-K1 的转染效率大于 80%。 • 毒性低：转染贴壁细胞形态良好，转染悬浮细胞的细胞活率大于90%。 • 操作简便：转染前后无需换液，可带抗生素和血清转染。无需冷冻保存，取用方便。 | |
慢病毒浓缩 | • 无需超速离心，简单快速。 • 慢病毒颗粒回收率可达到 90%，滴度最高可提高约 100 倍。 |
外泌体递送路线：工程化外泌体生产
工程化外泌体作为天然纳米递送载体，兼具低免疫原性和可工程化修饰的优势。通过多质粒共转染生产细胞，可获得同时装载 CAR-mRNA 并展示 T 细胞靶向配体的外泌体。
核心产品推荐:
分类 | 产品 | 特点 |
间充质干细胞培养 | 人间充质干细胞无血清培养基（GMP 级）(MM101 (含酚红)/MM102 (不含酚红)) | • 扩增高效：细胞粒径小，维持在 15-17 μm 之间；细胞产量高，P0 - P5 代可获 1012-1014 个脐带间充质干细胞。 • 安全性高：无血清、无异源成分。 • 有效性好：具有较高的成骨、软骨、脂肪细胞分化的能力和较强的免疫调节能力。 • 普适性高：适用于脐带、骨髓、脂肪等多种来源的间充质干细胞的原代分离培养和传代扩增培养，及人多能干细胞 衍生间充质干细胞的传代扩增培养。 • 医药品级原料：核心原料生产符合 FDA cGMP 标准，获 FDA DMF II 备案。 |
外泌体提取 | • 操作简单，无需超速离心，能够在 3 小时内完成外泌体纯化。 • 相较于超速离心法，特异性更强，纯度更高。 • 洗脱条件温和，提取的外泌体形态良好，结构完整，活性高。 | |
• 操作简单，无须超速离心。 • 样本需求量少，灵敏度高。 |
三、质量控制与验证
与体外 CAR-T 疗法不同，In vivo CAR-T 没有体外培养环节作为质量控制挡板，因此对递送载体的质量控制与标准化生产提出更高的要求。全式金提供从滴度、宿主残留到支原体检测的完整质控工具包。
1. 滴度测定
物理滴度（p24 蛋白）和感染滴度（转导单位）是慢病毒载体的关键质量属性，直接影响体内 CAR-T 细胞的生成效率和剂量准确性。
核心产品推荐:
分类 | 产品 | 特点 |
qPCR法 | • 简单快速、灵敏高效。 • 兼容第二代和第三代 HIV-1 慢病毒包装载体。 | |
ELISA 法 | • 检测范围广：3.13~200 pg/ml。 • 准确性高：回收率达 85 - 115%。 • 灵敏度高：1.0 pg/ml。 • 精密度好：批内差 CV%<10%，批间差 CV%<15% | |
• 检测范围广：31.3~2000 pg/ml • 准确率高：回收率 80%~120% • 灵敏度高：10.0 pg/ml • 精密度好：批内差 CV≤10%，批间差 CV≤15% • 操作简便：只需一步上样，全程孵育时间仅需 70 分钟 |
2. 宿主核酸残留检测
生产细胞（如 HEK293T）的残留 DNA 是病毒载体安全性评价的重要指标。全式金残留核酸检测系列采用 qPCR 法，特异性高，灵敏度高，含 dUTP/UDG 防污染系统，防止 PCR 产物污染带来的假阳性。
核心产品推荐:
产品 | 定量限 | 特点 |
1×10-2 pg/μl | • 特异性高，灵敏度高，扩增效率高，适用样品范围广。 • 特殊优化的 qPCR 反应缓冲液，可提供更高的延伸速度、灵敏度和特异性。 • 使用 UDG 酶和 dUTP，有效防止 PCR 产物的交叉污染，数据准确。 | |
1.5×102 copies/μl |
3. 支原体检测
支原体污染是细胞治疗产品的红线指标。全式金提供 qPCR、直扩 qPCR 和发光法三种技术平台，并适配不同样本类型和通量需求。
核心产品推荐:
分类 | 产品 | 特点 |
qPCR 法 | • 符合欧洲药典 EP 2.6.7 和日本药典 JP G3 • 覆盖范围广：已验证 13 株菌株及质粒 DNA 的支原体检测，数据库比对可覆盖至少 129 种支原体 DNA 序列。 • 灵敏度高：验证的支原体满足 95% 的检出要求，检测限可达 10 CFU/ml；质粒标准品可达 1 copy/μl。 • 特异性高：常见的近 20 种细菌、生产用细胞等基因组无检测干扰。 • dUTP/UDG 防污染系统：有效防止 PCR 产物的污染，数据准确。 • 稳定性高：产品至少可冻融 15 次，产品性能无明显影响。 • 可搭配磁珠法支原体 DNA 提取试剂盒（EH401）, 从生物样本中高效提取支原体 DNA。 | |
直扩 qPCR 法 | • 样本直扩：样本无需预处理，直接加样即可。 • 检测快速：免提取，检测更为快速，70 min 完成扩增。 • 灵敏度高：最低可检支原体质粒标准品 10 copies。 • 抗抑制强：对常用的细胞培养基，胎牛血清等常见基质均可扩增。 • 特异性好：与多种细菌和工程细胞进行交叉验证，无非特异扩增。 • 覆盖度广：可检测的支原体种类多达 129 种。 • 稳定性好： 反复冻融 15 次后性能无明显变化。 | |
发光法 | •操作简便省时，仅需两步操作，20 分钟出结果。 •灵敏度高，可检测低至 50 CFU/ml，有效避免假阴性结果。 •复孔间重复性好，结果判定更准确。 |
四、细胞平台与体内模型验证阶段
尽管 In vivo CAR-T 避免了体外细胞培养环节，但在研发阶段仍需要在细胞模型中验证各种递送载体对 T 细胞的特异性转导/转染效率、CAR 表达水平、以及 T 细胞的活化、增殖和杀伤功能。全式金提供从细胞培养、冻存到功能检测的全套试剂。
核心产品推荐：
分类 | 产品 | 特点 |
T 细胞无血清培养基 | GMP 级 T 细胞无血清培养基 (MT101 ( 含酚红)/MT102 ( 不含酚红))
| • 自主研发。 • 无血清、无异源成分，化学成分明确。 • 支持 T 细胞的快速扩增和高密度培养。 • 兼容多种 T 细胞激活方法（抗体可溶法、抗体包被法、磁珠偶联抗体法）。 • 按照 GMP 标准生产和管理。 |
细胞冻存液 | • 安全：无血清，无动物源成分，无蛋白，无 DMSO，化学成分明确，完全使用“ 医药品” 级原料，已完成毒性实验。 • 高效：有效提高细胞复苏存活率，大部分细胞（包括间充质干细胞和免疫细胞）复苏率可达 90% 以上。 • 便捷：即用型产品，且无需程序性降温。 | |
细胞检测 | • 快速，灵敏。 • 细胞毒性低。 • 线性范围广。 • 结果稳定，重复性好。 | |
• 试剂不含有刺激性气味成分，使用更安全。 • 裂解和检测一步完成，无需洗涤、收集细胞。 • 化学发光信号强，灵敏度高。 • 10 min 内即可完成 96 孔板检测。 • 半衰期为 30-40 分钟，适用于 5 块 96 孔板通量检测。 • ICH 指导方法预验证 | ||
• 荧光值高：信号强度显著提升，低细胞量下仍可获取明亮、可区分的发光信号 • 半衰期长达 3 小时，加样后 1 小时内发光信号稳定维持在 85% 以上 • 线性范围广：10~100,000 个细胞均具有良好的线性关系 • 可视化颜色指示：试剂自带颜色，有效避免漏加、错加 • 融化速度快：优化配方，从低温取出后快速融化，节省等待时间 • 操作简单：单一组分试剂，加入细胞培养物后仅需10分钟即可检测；可高通量检测 | ||
ELISA 检测 | • 灵敏度高，低至 pg 级，线性范围广 • 抗体预包被，操作简单便捷 • 检测靶标：Human IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、FGF basic |
In vivo CAR-T 以“即用型”制剂替代传统个体化制备流程，有望从根本上解决可及性与成本瓶颈，成为细胞治疗的下一个技术高地。当前领域已形成病毒载体、LNP 递送、外泌体递送三线并进的格局。全式金生物深耕生物试剂自主研发十余年，产品覆盖基因克隆、病毒包装、转染试剂、细胞培养、质量控制等关键环节，并在 CAR-T 免疫治疗、干细胞治疗等领域形成成熟布局。
全式金 In vivo CAR-T 全链条解决方案
研发阶段：支持 CAR 基因设计与包膜蛋白改造、靶向分子筛选验证。
载体生产阶段：提供 GMP 级 PEI 转染试剂、确保稳定高效、批次间均一的高滴度病毒生产；并有外泌体提取纯化相关产品线持续扩展。
质量控制：提供 p24 ELISA（物理滴度检测）、慢病毒 qPCR 滴度检测、支原体检测等质控工具，符合 GMP 质量管理体系要求。
细胞平台：覆盖 GMP 级细胞培养基、细胞冻存及功能检测试剂等细胞培养环节的核心需求。
全式金生物将持续以扎实的技术与产品输出，赋能细胞治疗创新企业，助力中国生物医药产业在 In vivo CAR-T 这一全新赛道上抢占先机。
