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细胞培养常见问题解答

Q:培养基 pH 值异常

A:

• 二氧化碳分压设置错误:根据培养基中碳酸氢钠的浓度而增加或降低培养箱中二氧化碳分压。

• 培养箱无二氧化碳:定期观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。

• 细胞培养瓶盖拧得过紧:将盖子旋松 1/4 圈,或换成透气盖培养瓶。

• 细菌、真菌污染 丢弃细胞和培养基。

• 培养基中的平衡盐不匹配:二氧化碳平衡环境中使用以 Earle's 平衡盐为基础的培养基,大气条件下使用以Hank's 平衡盐为基础的培养基。

• 碳酸氢盐缓冲系统缓冲能力不足:加入 HEPES 缓冲液,使其终浓度为 10-25 mM。


Q:细胞生长缓慢

A:

• 培养基或血清改变:比较不同培养基中葡萄糖、氨基酸等成分有无差异;增加细胞接种密度;更换新鲜培养基。

• 必需生长促进成分 ( 如 L- 谷氨酰胺或生长因子 ) 缺乏、耗尽或降解使用新鲜培养基或向现有培养基中添加必需成分。

• 细胞初始接种密度过低:增大细胞接种密度。

• 支原体污染:检测培养物有无支原体污染,如果被污染,则弃之,或用支原体清除试剂进行清除。

• 细胞代次过高:取用新的细胞。

• 轻度细菌或真菌污染:在添加抗生素的培养基中培养细胞,如果培养物被污染,则弃之。

试剂储存不当血清应置于-5℃至 -20℃下储存 ;培养基应置于 2-8℃下避光储存;完全培养基应置于2-8℃下避光储存,并限在2周内使用。


Q:细胞死亡

A:

• 胰酶消化过度:缩短胰酶消化时间或降低消化用胰酶的工作浓度。

• 细胞状态差:取用新的细胞。

• 支原体污染:检测培养物有无支原体污染,如果被污染,则弃之,或用支原体清除试剂进行清除。

• 培养基中无附着因子:如采用无血清培养方法,应确保其含有附着因子,或使用包被过的培养器皿。

• 培养箱中无二氧化碳:定期观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。

• 培养箱温度有波动:监测培养箱内温度。

• 转染试剂毒性过强,细胞代次过高,质粒纯度差使用低毒性的转染试剂或在转染后及时换液;使用低代次细胞转染 ;使用高品质的质粒转染。

• 细胞解冻或冻存过程中损伤大:取用新的细胞。

• 培养基的渗透压不正确:检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受的渗透压为 260-350 mOsmol/kg,昆虫细胞可耐受的渗透压为 340-380 mOsmol/kg。

• 培养基中有毒代谢产物蓄积过多:更换新鲜培养基。

Protein Marker使用常见问题解答

Q:条带模糊的原因?

A:

• 电压过高或电泳时间过长,产热过多导致电泳缓冲液温度升高。建议参照Trans产品使用说明书。

• 电泳缓冲液陈旧,建议使用新鲜的电泳缓冲液,为了获得理想的结果建议在使用前预冷缓冲液。

• 分离胶的浓度偏低,建议使用合适的胶浓度。

• 凝胶放置时间过长,建议使用新配制的凝胶电泳。


Q: 为什么有时候带型不整齐?

A:

• 建议点样时将蛋白Marker放在泳道中间。如在凝胶两侧泳道,由于边缘效应、离子强度不均等原因,均会导致带型变宽或弯曲。

• 凝胶配制不匀,凝胶内存有气泡,或点样孔中有细碎的残胶。


Q:电泳时蛋白Marker分离不开?

A:大多为胶浓度不合适,要在推荐的凝胶浓度范围内使用。此外,比较陈旧的凝胶和缓冲液也会造成电泳效果不好。


Q:预染Marker电泳后清晰,但是转膜后颜色很浅?

A:

• 转膜时一定要将胶和膜压紧,否则条带会在转膜过程中丢失或变浅。

• 转膜条件不适合,建议200 mA、2小时,或100 mA过夜转膜。


Q:转膜时甲醇的浓度是多少,会对转膜造成什么影响?

A:甲醇的浓度一般推荐为15%,甲醇浓度太高易造成蛋白穿膜,转移到滤纸上。


Q:发光液配制需要避光吗?

A:不需要避光,但是要现配现用,配制后马上进入暗室进行下面的操作。


Q:发光液的有效曝光时间多长?

A:发光液在2小时以内均可以曝光,但是前30分钟曝光能力较强,随着时间的推移可适当延长曝光时间来调节曝光强度。


Q:曝光后X光片背景很黑是什么原因?

A:背景很黑可能是曝光时间太长或者显影时间过长造成的。


Q:Western Marker 曝光后杂带很多是什么原因?

A:Marker上样量过多或曝光时间过长,可适当减少上样量或曝光时间。此外,二抗的浓度过高或特异性和纯度不高,也会造成杂带较多的结果。

His标签蛋白纯化常见问题解答

Q:层析柱堵塞?

A:待纯化蛋白样品中存在固体杂质,多见于菌体裂解液直接上样。建议对样品微滤 (0.45μm) 处理。


Q:目的蛋白不与介质结合?

A:

• 目的蛋白没有 His 标签,其原因可能是载体构建有误、表达提前终止 (C端融合表达His 标签)、二级翻译起始 (N端融合表达His标签)等等。建议测序检查,或尝试更换表达载体。

• His标签折叠在蛋白质内部没有暴露。该情况多见于包涵体蛋白在变性条件下的纯化。建

议充分变性蛋白,可以尝试使用更强的变性剂 (如用6 M盐酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶剂 (SDS) 或还原剂 (DTT、β-巯基乙醇) 等方法。

• 缓冲液存在问题。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介质纯化 His 标签蛋白时,平衡缓冲液与样品缓冲液中的某些组分可能会干扰目的蛋白的结合。

部分组分建议浓度如下 :

 EDTA: ≤0.1 mM (建议不要使用)

 DTT: ≤1 mM (不推荐使用)

 β-巯基乙醇: ≤20 mM (慎用)

 咪唑: ≤20 mM (因蛋白而异)


Q:洗脱液中杂蛋白多?

A:

• 洗脱条件不合适。建议使用咪唑浓度梯度或 pH 值梯度洗脱。不同蛋白质最佳洗脱条件不同,需要摸索优化。

• 杂蛋白与介质存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入一定浓度的咪唑 (推荐浓度 : ≤20 mM,因蛋白而异),抑制非特异性结合。

• 杂蛋白与目的蛋白存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入非离子型去垢剂 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、还原剂 (β- 巯基乙醇 : ≤20 mM) 等组分。

• 目的蛋白降解。建议在低温下纯化目的蛋白,并在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂 (如 PMSF)。

• 存在表达提前终止 (C 端融合表达 His 标签) 或二级翻译起始 (N端融合表达 His 标签)。建议更换表达载体。


Q:目的蛋白没有洗脱?

A:

• 目的蛋白量太少,无法检出。建议更换灵敏度更高的检测方法,如用银染法或 Western Blot 替代考马斯亮蓝染色,或优化上游表达条件,获得更多的目的蛋白。

• 目的蛋白没有结合介质。建议检测以下全部样品以确认蛋白:上样前、流出、洗涤、洗脱。

• 目的蛋白结合牢固。建议增加洗脱强度,如采用更高浓度的咪唑或更低的 pH 值。

原核蛋白表达常见问题解答

Q:蛋白不表达或表达量很低?

A:

1、选择正确的表达载体与表达菌株

• T7启动子的载体(如pET系列载体)应选用BL21(DE3),BL21(DE3) pLysS,Transetta(DE3) 等菌株。非T7启动子的表达载体 (如Tac启动子的pGEX、pMAL系列表达载体) 应选用BL21表达菌株。

• 对细胞有毒性的蛋白,建议选用背景表达低、严谨调控诱导的菌株,如BL21(DE3) pLysS菌株。

• 对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白,建议选用Transetta(DE3) 等菌株。

2、尝试不同的表达载体与菌株

   不同的蛋白,对不同载体与菌株的偏好不同,如果某一蛋白无法通过优化诱导表达条件得到明显改善,可以更换其它菌株或表达载体。

3、表达条件的优化

• 选择不同的培养基。对于某些蛋白,在培养基中加入适量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明显提高表达量。

• 较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间,一般可以加快表达的速度,促进目的蛋白的积累,从而提高表达量。但可能会降低可溶蛋白的表达量,形成包涵体。

• 细胞的生长状态对蛋白表达有很大的影响,可以通过测量菌液的OD600值监测生长状态。对于大部分蛋白,应在菌株的对数生长期(OD600=0.5) 进行诱导。


Q:目的蛋白不可溶,形成包涵体?

A:

首先确认目的蛋白是否有表达。

• 裂解菌体并离心后,通过对全菌、上清、沉淀的检测,确认目的蛋白是否表达,是否形成了包涵体。

• 包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下,可以尝试不同的表达载体与菌株,增强其溶解能力,优化出适合特定蛋白的表达系统。

• 目前认为包涵体的形成是由于蛋白在细胞内积累速度过快,没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件,如降低诱导温度、降低诱导物浓度、缩短表达时间、降低诱导时菌液的OD值等,以减缓蛋白的积累。


Q:目的蛋白大小不正确?

A:

• 蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白,从而准确判断蛋白分子量大小。

• 确认蛋白表达是否完整,蛋白是否提前终止表达。

• 若形成二聚体甚至多聚体,可以通过加热变性蛋白、打开二硫键 (加入DTT、β-ME等还原剂) 等手段,破坏次级结构,准确判断分子量大小。


                                                     

RNA纯化常见问题解答

Q:提取过程中 RNA 降解

A:

• 材料中的 RNA 发生降解:尽量选择新鲜的材料,材料采集后应迅速用液氮处理。材料

保存在液氮中或 -70℃条件下,材料均不宜长期保存,且避免反复冻融。幼嫩新鲜的材料 RNA 含量高且完整,衰老或病害等受损的材料中 RNA 降解比较严重。

• 操作环境的 RNase 污染:RNA 提取尽量选择洁净的环境,由于自然条件下空气中含有较多的 RNase,建议对提取环境进行 RNase 的清除处理。

• 提取用具带来的 RNase污染:提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活 (160℃烘烤 4-5 小时)去除 RNase。RNA 材料所接触的所有塑料制品 (如枪头、电泳槽、移液器等)都需要通过 DEPC 或 NaOH 处理严格去除 RNase 后才可使用。

• 操作中带入的 RNase 污染:人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的 RNase。操作人

员可通过经常更换一次性手套,佩戴口罩等措施减少此类污染。


Q:RNA 提取量低

A:

• 材料 RNA 含量较低:对于 RNA 含量较低的纤维组织 (肌肉组织或纤维素较高的植

物组织) 可适当提高起始材料的用量。

• 材料中蛋白和脂肪含量较高:蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例为严

格的 1:1,否则会明显影响 RNA 沉淀的效率和 RNA 的纯度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。


Q:RNA 中有基因组 DNA 污染

A:

• 材料中核酸含量高:脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高,可进行多次酚 / 氯仿抽

提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理,降解 DNA。

• 材料过量:增加试剂用量。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例偏高,

溶液的 pH 值偏小,都容易使 DNA 形成沉淀。


Q:提取后的 RNA 样品降解

A:

• RNA 样品反复冻融:反复冻融会使 RNA 片段断裂,影响 RNA 的完整性。

• RNA 样品保存条件不合适:根据保存时间和材料的不同,RNA 应保存在不同的溶液中。

如从胰脏、肝脏等 RNase 含量较高的材料中提取的样品需要储存在甲醛或甲酰胺中以保存高质量的 RNA,而在脾脏中提取的 RNA 可在水中长期稳定保存。

RNA纯化常见问题解答

Q:提取过程中 RNA 降解

A:

• 材料中的 RNA 发生降解:尽量选择新鲜的材料,材料采集后应迅速用液氮处理。材料

保存在液氮中或 -70℃条件下,材料均不宜长期保存,且避免反复冻融。幼嫩新鲜的材料 RNA 含量高且完整,衰老或病害等受损的材料中 RNA 降解比较严重。

• 操作环境的 RNase 污染:RNA 提取尽量选择洁净的环境,由于自然条件下空气中含有较多的 RNase,建议对提取环境进行 RNase 的清除处理。

• 提取用具带来的 RNase污染:提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活 (160℃烘烤 4-5 小时)去除 RNase。RNA 材料所接触的所有塑料制品 (如枪头、电泳槽、移液器等)都需要通过 DEPC 或 NaOH 处理严格去除 RNase 后才可使用。

• 操作中带入的 RNase 污染:人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的 RNase。操作人

员可通过经常更换一次性手套,佩戴口罩等措施减少此类污染。


Q:RNA 提取量低

A:

• 材料 RNA 含量较低:对于 RNA 含量较低的纤维组织 (肌肉组织或纤维素较高的植

物组织) 可适当提高起始材料的用量。

• 材料中蛋白和脂肪含量较高:蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例为严

格的 1:1,否则会明显影响 RNA 沉淀的效率和 RNA 的纯度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。


Q:RNA 中有基因组 DNA 污染

A:

• 材料中核酸含量高:脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高,可进行多次酚 / 氯仿抽

提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理,降解 DNA。

• 材料过量:增加试剂用量。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例偏高,

溶液的 pH 值偏小,都容易使 DNA 形成沉淀。


Q:提取后的 RNA 样品降解

A:

• RNA 样品反复冻融:反复冻融会使 RNA 片段断裂,影响 RNA 的完整性。

• RNA 样品保存条件不合适:根据保存时间和材料的不同,RNA 应保存在不同的溶液中。

如从胰脏、肝脏等 RNase 含量较高的材料中提取的样品需要储存在甲醛或甲酰胺中以保存高质量的 RNA,而在脾脏中提取的 RNA 可在水中长期稳定保存。

质粒DNA纯化常见问题解答

Q:产量低

A:

• 检查细胞生长情况,培养条件是否适合质粒增殖。尽可能选择高拷贝数的质粒。

• 如果质粒拷贝数低,可适当增加收集的菌液量,但是要保证菌体可以被完全裂解。

• 如果裂解液过于粘稠,应适当减少菌体量。

• 培养时间过长或在 2-8℃保存时间过长会明显降低产量,建议使用新鲜的菌液。


Q:质粒 DNA 中有基因组 DNA 污染

A:裂解时间不宜超过 5 分钟。


Q:影响下游酶切

A:洗涤液 WB 洗涤后应尽量离心去除残留的液体,待硅胶膜完全干燥后再加入洗脱缓冲液。

基因组DNA纯化常见问题解答

Q:DNA 产量低

A:

• 裂解不充分:减少起始材料的用量。检查样品中是否加入了 Proteinase K溶液。如果提取的材料为动物组织,尽量将组织切碎,并要保证材料完全浸泡在裂解液中。适当延长裂解时间。

• 提取材料质量不好:尽量选用新鲜材料,样品采集后应尽快保存在 -70℃或液氮中。DNA 的产量取决于材料的种类和幼嫩程度。

• 离心柱堵塞:过柱前检查裂解液是否清亮,去除溶液中过于粘稠的不溶物。

• 洗涤溶液中未添加无水乙醇。必须在洗涤溶液中添加合适比例的无水乙醇。

• 洗脱条件不合适:洗脱液 EB 或超纯水最好预先加热至 70℃,用超纯水洗脱前应检查其pH 值是否在 7.0-8.5 之间,如 pH 值小于 7 将明显影响洗脱效率,需调节后再进行洗脱。洗脱液应尽量加到离心柱的中央,在离心前室温静置 1 分钟。

• DNA 断裂或降解:避免因移液枪反复吹吸或反复冻融样品造成的 DNA 损伤。避免在操作过程中带入外源 DNase 污染。


Q:洗脱液颜色发黑或硅胶膜脱色 ( 动物组织或鼠尾材料 )

A:来源于组织的色素大量结合在离心柱上并与 DNA 一并洗脱:在过柱前检查是否已加入乙醇,乙醇可防止色素与硅胶膜结合。在裂解液结合步骤可适当加大转速和延长离心时间。

• RNA 污染:可在样品材料制备过程中添加适量的 RNase A 降解 RNA。


Q:影响下游的酶切

A:

• 纯化的 DNA 中有乙醇残留:在洗涤步骤中可能会带来乙醇的残留。加入洗脱液之前将离心柱在最大转速下离心 2-3 分钟彻底干燥离心柱。

• 纯化的 DNA 中有盐分残留:采用正确的洗涤操作步骤,用不同 CB 溶液洗涤后再用 WB 洗涤。

克隆常见问题解答

Q:如何选择合适的克隆载体?

A:Taq系列酶扩增的片段,选用T载体;Pfu系列酶扩增片段,选用Blunt系列载体,也可以加“A”后和T载体连接,但效果不如直接连接Blunt系列载体。如果PCR模板是质粒DNA,推荐使用双抗性载体。


Q:插入片段的量多少合适?

A:

• 片段加入量可根据片段长度不同进行调整。 最佳插入片段DNA量:载体与片段摩尔比=1:7

• 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例计算。(如1 kb加20 ng,1.5 kb加30 ng等)、(在胶上通过TransGen的DNA 分子量标准粗定量即可)

• 片段加入量最大为4μl,即使片段浓度很低也不要超过此限。片段加入量最少为0.5μl,可以补充无菌水以方便操作。

• 反应温度范围:20-37℃,最适反应温度为25℃。


Q:反应时间多长合适?

A:

• 大多数1 kb以内的PCR产物室温反应5分钟即可完成反应。以下几种情况可以延长反应时间以获得更理想的效果:

• 具有特殊结构(高AT/高GC/反向重复序列)的片段:10-20分钟。

• 胶回收片段或加"A"片段:10-15分钟(该条件适用于3 kb以内的片段)。

• 大于3 kb的PCR产物需延长至15-20分钟。


Q:连接产物可以保存多久?

A:连接产物可以置于-20℃或2-8℃冰箱,一周内使用。


Q:多克隆位点上的酶切位点切不开?

A:筛选到的克隆来源于模板质粒而不是连接产物。推荐使用双抗载体,筛选时使用模板质粒不具有的抗性。


Q:克隆数少或阳性率低?

A:

• 影响克隆数目和克隆效率的因素有许多,如感受态细胞效率、插入片段质量、基因结构、插入片段长度、插入片段和载体的比例等。如发现克隆数少或克隆效率低,可尝试下列方法:

• 感受态细胞的转化效率对克隆数有重要影响,转化效率高低与连接产物克隆数的多少不呈线性关系。假设细胞转化效率为1×109 cfu/µg DNA时,克隆数为1000;转化效率为1×108 cfu/µg DNA时,克隆数并不是100,而是低于100。为保证克隆数,请选用高转化效率的Trans1-T1感受态细胞。

• 使用新鲜的PCR产物:PCR产物于2-8℃保存,1-2天内使用。对于胶回收产物,应尽量缩短紫外照射时间并适当延长反应时间 (10-15分钟)。

• 目的片段浓度极低时,进行浓缩,以保证反应时分子碰撞机率。

• 毒基因:使用Trans10感受态细胞。

• 具有特殊结构 (高AT/高GC/反向重复序列) 的基因:适当延长反应时间至10-20分钟。


Q:PCR鉴定重组子失败?

A:当用通用引物鉴定重组子,没有得到目的扩增产物,又没有载体自连带,说明PCR失败。重新优化PCR条件或提取质粒,以质粒作模板扩增或酶切鉴定包含重组子的克隆。


Q:重组克隆呈现淡蓝色或“Fish eye”?

A:插入片段没有影响LacZ基因读码框,或插入片段太短 ,这种情况下克隆呈现淡蓝色或“Fish eye”,可正常鉴定。

DNA Marker使用常见问题解答

Q:电泳条带模糊?

A:

• 电泳缓冲液缓冲能力差。 电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲性能下降,可使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA条带迁移的现象。

• 电压过高,电泳时间过长。电泳时电压不应该超过20 V/cm,电泳温度应该低于30℃。如果电泳时电压和温度过高,可能导致出现条带模糊和不规则的DNA条带迁移的现象。特别是电压太高易出现缺带现象。电泳过程中由于会产热,因此电泳时间长容易发生条带模糊,特别是小片段会变得模糊。

• 凝胶放置时间太长或琼脂糖的质量差,导致DNA 条带分辨率降低。


QDNA Marker 降解?

A:污染了核酸外切酶。建议用灭菌的枪头,用后及时将管盖拧紧。点样时勿将电泳缓冲液带入管中,建议更换枪头。


Q:用EB琼脂糖胶电泳不同时间会出现条带亮度变化?

A:由于电泳过程中条带与EB泳动方向相反,结合EB的量会随时间变化,因此电泳后条带亮度会发生变化。因此建议使用EB染胶实现精准定量。


Q:DNA Marker电泳条带分离效果不好?

A:琼脂糖制胶浓度不合适,导致分辨率降低。制胶不均匀有时也会导致电泳异常。建议使用新制备的凝胶,制胶时注意操作中带来的浓度误差。一般对于大分子量片段,低浓度胶分离效果好;对于小分子量片段,高浓度胶分离效果好。


Q:不同核酸染料对DNA Marker 迁移率的影响?

A:预加GeneFinder、GelStain、GoldView到DNA Marker中,对Marker的迁移率都有一定的影响。

限制性内切酶常见问题解答

Q:不酶切或酶切不完全

A:

• 酶失活或浓度过低:用已知含目的酶切位点的对照 DNA 测试该酶活性;酶应贮存于 -20℃,-70℃时会冻结;避免反复冻融降低酶活;可根据实验要求适当加大酶

量。

• DNA 浓度不合适:推荐 50 μl 反应体系酶切 1-2 μg DNA;DNA 过量时可适当增加酶量。

• DNA 被抑制剂污染:与对照 DNA 样品一起酶切,验证其是否被抑制;重新纯化 DNA 样品。

• DNA 可能形成超螺旋:不同酶对超螺旋结构 DNA 消化效率不一样,可适当加大酶量。

• 识别位点过于接近 DNA 末端:一般在识别位点两端各加 6 个保护碱基可确保酶切效率。

• 识别位点不存在:验证 DNA 序列。

• 反应条件非最优化:缓冲液使用不当;按比例使用新鲜缓冲液重复实验;按照推荐方案进行双酶切或分步酶切。

• 甲基化封闭酶切位点:PCR 产物未甲基化;使用 dam-/dcm-菌株转化。


Q:出现非预期带型

A:

• 确定正确带型:酶切产物与对照 DNA 样品一起电泳,确定是未消化完的底物条带或者是星号活性产生的非预期条带。

• DNA 样品污染:重新制备或纯化样品

• 含其它酶切位点:验证 DNA 序列


Q:DNA 电泳呈弥散带

A:

• 酶与 DNA 结合紧密未完全解离:使用随酶提供的 DNA Loading Buffer 上样电泳;或另加入终浓度为0.05-0.2% 的 SDS。

• 核酸酶污染:制备新的底物样品;使用新的缓冲液和水。

• 电泳条件不合适:使用新鲜的电泳缓冲液和凝胶;合适的电流电压避免过热。


Q:星号活性 (特异性降低或改变)

A:

• 高甘油浓度 (>5% v/v):酶储存液含 50% 甘油;因此酶量不超过反应体积的10%。选择 50 μl的标准反应体系,以减少反应过程中水的蒸发而提高甘油浓度。

• 非最适缓冲液:尽可能使用推荐缓冲液,离子浓度和 pH 的改变会引起星号活性。

• 存在有机溶剂 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等):确保样品在制备过程中不含任何有机物,如 DNA 制备过程中可能混入的乙醇。

• 混有其它二价离子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除样品中二价离子

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