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qPCR常见问题解答

Q:Passive Reference Dye的作用是什么,如何使用?

A:它们是针对不同机器型号校正加样管间误差的参比荧光染料。它们的浓度为50×,使用时在20μl体系中加入0.4μl即可。

Q:CT值出现过晚?

A:可能是扩增效率低,反应条件不够优化。此外PCR各种反应成分的降解或者PCR产物太长 (一般采用80-250 bp的产物长度) 也会造成CT值出现过晚。

Q:qPCR SuperMix是否需要调整Mg2+浓度?

A:一般不需要调整,当PCR结果不理想或通过其它调整不能获得明显改善时,可以考虑通过调整Mg2+浓度以改进扩增结果。

Q:扩增曲线异常?

A:

• 基线设置有误。

• 高浓度的模板会导致CT值过早出现,即基线范围变小,导致机器读取荧光数值有误。

Q:重复性差?

A:

• 操作误差。

• 模板浓度过低会导致重复性变差,可适当提高模板浓度,降低稀释倍数。

• 机器本身的孔间温度不一致。

Q:NTC不为零,如何优化?

A:

• 提高退火温度。

• 降低引物工作浓度,如需要可降至60 nM。

• 尽量在冰上操作。

• 重新设计引物,必要时可设计多对引物,优中选优。

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