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PCR常见问题解答

Q: 扩增效率低:条带较弱或无扩增

A:

• 酶的原因:实验表明,PCR酶对于DNA具有一定的偏好性。如使用一种酶经过优化难以获得理想扩增时,可以尝试其它PCR酶。

• 模板引物的原因:确保模板、引物的品质,保证没有降解。另外,如果模板含有较多的抑制物时(如植物基因组模板),推荐使用抗抑制能力强的PCR酶;还可以对模板进行梯度稀释后扩增,摸索合适的模板用量。

• 反应体系与条件的原因:增加循环数、降低退火温湿度、适当提高Mg2+工作浓度,都可以提高扩增效率,但同时会导致特异性与保真性下降,需要根据具体的实验要求优化合适的条件。


Q: 扩增特异性差:引物二聚体、杂带、拖尾等

A:

• 选择热启动酶:与普通PCR酶相比,热启动酶具有更高的扩增效率和特异性。

• 优化反应体系与条件:升高退火温度可以有效提高特异性。另外减少循环数、适当降低Mg2+工作浓度,也可以提高特异性,但都会导致扩增效率的下降,需要根据具体的实验要求优化合适的条件。还可以尝试某些特殊的程序,如巢式PCR、Touch          Down PCR等。

• PCR产物需要进行后续实验时,如果确定有目的条带扩增,可以凝胶回收目的条带。


Q:扩增保真性差:突变、插入、缺失等

A:

• 选择高保真酶:B型DNA聚合酶,如Pfu系列酶,具有3’-5’的外切酶活性,能够校正错配的碱基,具有高保真性。另外,复合酶中由于有B型DNA聚合酶的存在,也具有较高的保真性,但保真性比B型DNA聚合酶要低。

• 优化PCR体系与条件:适当增加模板量、减少循环数,可以降低突变机率,提高保真性。

确认保真性低的原因:有时保真性低并非由PCR引起,PCR通常只会导致数量很少的单碱基突变。如果产物测序后,发现大量的突变,或有明显的插入、缺失等,很可能是来自其它实验步骤,如DNA在大肠杆菌中复制是发生重组,或是测序时的污染。这种情况,可以重新反转录或选保真性更高的反转录酶。


Q:Pfu酶扩增如何加“A”?

A:

• 在10 µl体系中,加入纯化后PCR产物、0.2 µl Taq DNA Polymerase、0.5 µl 10 mM dNTP (或0.5 µl 2.5 mM dATP)、1 µl 10xTaq Buffer, 72℃ 反应10-15分钟即可。


Q:出现假阳性扩增

A:

• 引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

• 靶序列或扩增产物的交叉污染:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

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